流式細(xì)胞以檢測(cè)分析的對(duì)象是細(xì)胞或者細(xì)胞樣顆粒性物質(zhì)，所以流式細(xì)胞術(shù)是細(xì)胞學(xué)的重要研究手段之一下面我們介紹一下用于流式細(xì)胞儀分析的單細(xì)胞懸液。

獨(dú)立細(xì)胞樣品的制備

1. 如果是是懸浮細(xì)胞則直接收集細(xì)胞于離心管，離心沉淀細(xì)胞，用PBS重懸洗一次，然后固定待測(cè)，或取適量細(xì)胞與EP管中，標(biāo)記相應(yīng)的熒光偶聯(lián)抗體，zui后吸取未結(jié)合的抗體，然后固定待測(cè)。
2. 如果細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需要胰酶消化細(xì)胞適當(dāng)時(shí)間后，用移液器反復(fù)吹打，收集待測(cè)樣品細(xì)胞，離心后固定，或標(biāo)記抗體。
   • 將培養(yǎng)細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，至顯微鏡下見(jiàn)到貼壁細(xì)胞回縮變圓為止，棄掉消化液，加入PBS用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來(lái)，并移入離心管中。
   • 短時(shí)低速離心，即1000r/min離心5min
   • 棄上清，加pH 7.4的PBS液洗2次，1000r/min離心5min，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片
   • 加入固定液固定或低溫保存待用。
3. 如果研究對(duì)象是外周血，根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞的不同可以有兩種處理方法。如果研究對(duì)象是外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）,zui常用的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度離心法。

Ficoll-hypague密度梯度離心法分離PBMC：

• 抽取適量的血液于離心管中，該離心管必須事先加上抗凝劑，防止血液凝固。
• 用PBS稀釋血液，稀釋倍數(shù)可以根據(jù)血液的稠度加以調(diào)整，一般以2-4倍為宜。
• 根據(jù)血液的總量選用15ml離心管或者50ml離心管，先加入離心管1/4體積的Ficoll分離液，然后慢慢將稀釋后的血液小心疊加到Ficoll分離液的上層，體積是Ficoll液體積的2.5-3倍為宜。注意疊加血液時(shí)一定要輕柔，避免加入的血液與Ficoll液相混合，這一步很關(guān)鍵，如果血液層與Ficoll液層互相混合，就無(wú)法成功分離PBMC
• 將離心管在水平離心機(jī)中離心，2000r/min離心30min。
• 取出離心管，此時(shí)離心管內(nèi)的液體分為三層，上層為血漿，中層為含PBMC的Ficoll液，zui下層為紅細(xì)胞，注意此時(shí)要輕拿輕放，切勿將分層的液體重新混勻。PBMC主要位于Ficoll液的上層，即血漿與Ficoll液層的交界處，肉眼見(jiàn)到的混濁絮狀物就是PBMC，用吸管小心吸取中層的Ficoll液，盡量吸盡其中的混濁絮狀物，吸入少量血漿不會(huì)影響結(jié)果，但需避免吸入zui下層的紅細(xì)胞。

將得到的含有PBMC的中層Ficoll分離液置于新的離心管中，用PBS稀釋?zhuān)辽傧♂屢槐?。?/SPAN>PBS稀釋步驟*，如果不經(jīng)PBS稀釋直接離心，則離心

• 時(shí)無(wú)法有效沉淀PBMC，因?yàn)?/SPAN>PBMC密度小于Ficoll液，不稀釋直接離心時(shí)PBMC仍將位于Ficoll分離液上層。
• 低速離心10min。使PBMC沉淀，而血小板懸浮于上層液體中，棄去含有血小板的上層液體。如果血小板去除不滿意，可以重復(fù)低速離心一次。
• 用PBS重懸PBMC沉淀，1500r/min離心10min，沉淀即為PBMC。
• 用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭ɑ蛑玫蜏乇浔４妗?/SPAN>

如果研究對(duì)象是包括多核粒細(xì)胞的外周血白細(xì)胞，就不能用Ficoll-hypague密度梯度離心法，因?yàn)樵摲〞?huì)同時(shí)去除多核粒細(xì)胞和紅細(xì)胞。這時(shí)可以采取直接用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞的方法，然后多次低速離心去除紅細(xì)胞碎片即可。

收集人的外周血方法比較簡(jiǎn)單，直接靜脈采血，收集于抗凝管中即可。收集小鼠的外周血zui常用的方法是眼眶取血法。

如果研究對(duì)象是胸水、腹水、腦脊液等體液內(nèi)的細(xì)胞，只需直接將標(biāo)本離心，PBS重懸沉淀 ，然后細(xì)胞固定或低溫冰箱保存。

胸、腹水脫落細(xì)胞的制備：

a．抽取胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放入鹽水瓶置于4℃冰箱中靜置6-12h，棄去上清

b．將底部10-20ml用長(zhǎng)吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500r/min離心沉淀5min

c．再加入5ml PBS，用300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清

d．加固定液或低溫保存