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一.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF試劑盒檢測(cè)原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。特異性抗人IL-12p70單克隆抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本，經(jīng)過(guò)孵育，樣本中存在的IL-12p70與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入生物素化的單克隆抗體，孵育。洗滌去除未結(jié)合的生物素抗體，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（S-HRP）。洗滌，加入顯色底物TMB，避光顯色。終止液終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)（參考波長(zhǎng)570-630 nm）測(cè)定吸光度值。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中IL-1α的濃度成正比。

二.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF試劑盒樣本采集與貯存
細(xì)胞培養(yǎng)上清 沉淀之后即刻檢測(cè), 或者分裝，-20℃貯存。避免反復(fù)凍融。

血清樣本 分離管分離血清。在1000 g離心之前，使血樣凝集30分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測(cè)，或者分裝，-20℃貯存。避免反復(fù)凍融。

血漿樣本 EDTA，枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。在血樣收集 30分鐘內(nèi)離心收集樣本。即刻檢測(cè)，或者分裝，-20℃貯存。避免反復(fù)凍融。 本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本。

注意：檢測(cè)前，樣本中可見(jiàn)的沉淀必須去除。不要使用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。 樣本應(yīng)該被分裝并貯存于-20℃，以避免人IL-6活性的丟失。如果在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)，樣本可以存放在2-8℃。 避免樣本的反復(fù)凍融。在分析前，冷凍樣本應(yīng)該緩慢的恢復(fù)至室溫，輕柔地混勻。

三.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF試劑盒檢測(cè)步驟:

1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。 2. 將不需要的板條拆卸下來(lái)，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口。 3. 300 μl洗液洗板兩次，加入300 μl洗液靜置浸泡15分鐘。為了獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請(qǐng)立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。 4. 每孔加入50 μl檢測(cè)緩沖液。 5. 加入50 μl的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本和對(duì)照品。保證連續(xù)加樣，請(qǐng)不要間斷。加樣過(guò)程在15分鐘內(nèi)完成。 6. 每孔加入50 μl檢測(cè)抗體。 7. 使用封板膜封板。100轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育2小時(shí)。8. 棄掉液體，每孔加入300 μl洗液洗板，洗滌6次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)性能，必須*移除殘留液體。 9. 每孔加入100 μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。 10. 使用新的封板膜封板。100轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育45分鐘。 11. 重復(fù)步驟8。 12. 每孔加入100 μl顯色底物TMB，避光，室溫孵育10-30分鐘。 13. 每孔加入100 μl終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請(qǐng)輕輕叩擊板框，充分混勻。 14. 在30分鐘之內(nèi)，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。如果能夠進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，參考波長(zhǎng)設(shè)定為570 nm或者630 nm。如果不能雙波長(zhǎng)檢測(cè)，請(qǐng)用450 nm的測(cè)定值減去570 nm或630 nm的測(cè)定值。僅使用450 nm測(cè)定會(huì)導(dǎo)致OD值偏高，并且準(zhǔn)確度降低。